Philippe Duquesne commence sa carrière en jouant dans Les Deschiens, l'hilarante mini-série de Canal + diffusée pendant le programme Nulle Part Ailleurs dans les années 1990, aux côtés notamment de François Morel et de Yolande Moreau. Parallèlement, il tient de petits rôles au cinéma, parfois dans des films importants, comme Elisa (1995), de Jean Becker, dans lequel il campe le propriétaire du P.M.U. En 1998, il rencontre Jean-Marc Barr qui le fera jouer dans trois de ses films : Lovers en 1999, Being light en 2001 et Chroniques sexuelles d'une famille d'aujourd'hui en 2012.
C'est souvent dans les téléfilms qu'on le voit endosser des rôles plus importants dans les années 2000 : ainsi, il incarne Paul, le héros de Nos Familles (2007), un drame familial autour de l'autisme. On le retrouve également aux côtés d'Isabelle Carré dans Maman est folle (2005) et de Bruno Salomone dans Big Jim (2009). Philippe Duquesne joue aussi régulièrement dans des courts métrages. On peut citer Mon homme (2007), Petites révoltes du milieu (2010), ou Les Chiens verts (2012). En même temps, il s'illustre sur les planches par le biais de nombreuses pièces, et collabore à deux reprises avec Albert Dupontel réalisateur (Enfermés dehors en 2006 et Le Vilain en 2009).
Côté cinéma, il reste très présent, interprétant des seconds rôles remarqués. En 2004, Yolande Moreau, sa comparse des Deschiens, lui offre le rôle d'un patron de café dans Quand la mer monte, César de la Meilleure première oeuvre en 2005. Il participe, en 2004 également, à la fresque Un long dimanche de fiançailles de Jean-Pierre Jeunet. Variant les registres, on peut le voir en postier dans Bienvenue chez les Ch'tis, immense succès de Dany Boon, en 2008, et en Lucky Sarcelles dans le Gainsbourg (Vie héroïque) de Joann Sfar. En 2013, ce visage familier du cinéma français incarne l'un des personnages principaux de la comédie Turf, tendre satire sur le milieu des paris hippiques.
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