Diplômée du Neighborhood Theatre de New York, Mary Steenburgen fonde une petite troupe de théâtre, les Cracked Tokens, qui s'installe au Manhattan Theatre Club et remporte un certain succès.
Elle est aussitôt remarquée par Jack Nicholson qui lui confie en 1978 son premier rôle au cinéma, celui de Julia Tate dans En route vers le Sud. Ce western lui vaut d'ailleurs une nomination aux Golden Globe Awards en 1978. Elle donne ensuite la réplique à son futur époux, Malcolm McDowell, dans C'était demain, un film fantastique de Nicholas Meyer, et connaît la gloire en 1980, année durant laquelle elle remporte l'Oscar de la meilleure actrice pour son interprétation de Lynda Dummar dans Melvin and Howard, un film de Jonathan Demme sur la vie de l'excentrique Howard Hughes.
Dans les années 80, Mary Steenburgen joue souvent le rôle d'une épouse ou d'une mère de famille effacée (Ragtime (1981) de Milos Forman, Comédie érotique d'une nuit d'été (1982) de Woody Allen, Portrait craché d'une famille modèle (1990) de Ron Howard) et s'illustre dans de nombreuses comédies familiales (One magic Christmas (1985) de Phillip Borsos, Miss Firecracker (1989) de Thomas Schlamme, Retour vers le futur III (1990) de Robert Zemeckis). Mais elle s'impose également dans des films à tonalité plus dramatique : Marjorie, un drame de Martin Ritt où elle incarne l'écrivain Marjorie Kinnan Rawlings, et Froid comme la mort (1987) d'Arthur Penn, où elle interprète trois personnages féminins impliqués dans une sombre histoire de meurtre.
Dans les années 90, elle apparaît coup sur coup dans Gilbert Grape (1993) de Lasse Hallström, Philadelphia (1993) de Jonathan Demme, Powder (1995) de Victor Salva ou encore Nixon d'Oliver Stone. Après avoir essentiellement oeuvré pour la télévision dans la deuxième moitié de la décennie, elle retrouve en 2001 le grand écran grâce à Une maison sur l'océan, un drame familial de Irwin Winkler avec Kevin Kline dans le rôle principal.
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