John Turturro, d'abord attiré par le basket-ball, se dirige vers des études d'art dramatique. Après quelques années de théâtre, il fait ses premiers pas au cinéma en 1980 en décrochant un petit rôle au culot lors d'une audition improvisée pour Raging Bull. Le réalisateur Martin Scorsese le réemploiera d'ailleurs six ans plus tard dans La Couleur de l'argent.
Entre 1980 et 1986, on voit apparaître la longue silhouette gauche de John Turturro chez d'autres grands cinéastes tels que Woody Allen (Hannah et ses soeurs - 1986) ou Michael Cimino (Le Sicilien - 1987). La fréquentation du cinéma d'auteur ne l'empêche pas de s'essayer dans le même temps à des films plus commerciaux comme Le Kid de la plage ou Exterminator II.
John Turturro obtient son premier grand rôle en 1987 dans Five corners de Tony Bill, aux côtés de Jodie Foster et Tim Robbins. Mais ce sont Joel et Ethan Coen qui vont véritablement le révéler au grand public, tout d'abord en 1990 dans Miller's Crossing, puis surtout dans Barton Fink, Palme d'Or au Festival de Cannes 91 où son rôle de scénariste coincé lui vaut le Prix d'interprétation.
Dès lors, John Turturro est omniprésent. Il tourne à sept reprises avec Spike Lee (de Do the right thing à Summer of Sam) et deux fois avec les frères Coen (The Big Lebowski et O'Brother). On le voit sous la direction de réalisateurs aussi divers que Francesco Rosi (La Trêve), Robert Redford (Quiz Show), Diane Keaton (Les Liens du souvenir) ou encore Tim Robbins (Broadway 39e rue).
L'acteur change souvent de registre et collectionne les genres. Il apparaît dans le rôle d'un psychopathe dans le film fantastique Fenêtre secrète (2003) où il donne la réplique à Johnny Depp, qu'il a d'ailleurs déjà croisé dans The Man who cried et The Source. On le voit aussi bien dans des comédies face à Adam Sandler (Mr. Deeds, Self control) ou Sigourney Weaver (Company man) que dans des films d'action comme Dommage collatéral aux côtés d'Arnold Schwarzenegger ou des thrillers tel Inside job, dans lequel il campe un homme décidé à résoudre le meurtre de sa femme.
Marié depuis 1985 à l'actrice Katherine Borowitz, avec laquelle il a tourné plusieurs films, John Turturro passe derrière la caméra avec Mac, long-métrage revenant sur la vie d'ouvrier de son père, qu'il a également écrit et interprété, et qui lui permet de remporter la Caméra d'Or au Festival de Cannes 1992. Il dirige ensuite Christopher Walken, Susan Sarandon et Ben Gazzara dans Illuminata (1998). Mais Turturro ne cesse toutefois jamais de tourner, affichant un éclectisme étonnant. En 2006, il tourne ainsi pour Robert De Niro dans Raisons d'Etat. L'année suivante, il est au générique du blockbuster Transformers de Michael Bay. Et en 2008, il retrouve le fidèle Spike Lee pour son film de guerre Miracle à Santa-Anna.
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